今天為大家介紹 一項 2024 年由哈佛大學團隊開發並發表在《Nature Biotechnology》期刊上的新型基因編輯技術—點擊編輯（Click Editing）。這項技術為遺傳病治療、農業育種等領域提供了更安全、靈活的基因編輯工具，也為基因組工程領域帶來了全新的可能性。
什麼是點擊編輯?
點擊編輯是將 DNA 聚合酶（DNA-dependent polymerases，DDPs）、HUH 內切核酸酶（HUH endonucleases，HUHes）和 Cas9 切口酶（Cas9 nickase，nCas9）巧妙地結合，實現精准基因組編輯或修飾。點擊編輯使得研究人員在不產生有害雙鏈斷裂的情況下，精確地向基因組中引入特定的修改。相比于傳統的 CRISPR-Cas9 技術系統，點擊編輯顯著降低了不需要的插入和刪除，即不需要的基因序列發生的插入或缺失改變（indels）以及染色體重排的風險。
點擊編輯工作原理
點擊編輯技術系統相當精妙！其工作原理可以簡要概括：首先，使用經過修飾的 nCas9 切割 DNA 的一條鏈而不是兩條鏈；其次，利用系統中 HUHes 與單鏈 DNA 形成共價鍵；最後，由系統中 DDPs 負責合成新的 DNA（圖 1）。具體步驟如下（圖 1）：
1、RNA 引導的 nCas9 被導向目標基因組位元點並在非靶鏈上產生一個缺口；
2、HUHes 與攜帶編輯資訊的「點擊 DNA（click DNA，clkDNA）」範本形成共價鍵，將其錨定在目標位元點上；
3、clkDNA 的引物結合位點（primer binding site，PBS）與基因組的非靶鏈配對；
4、DDPs 使用 clkDNA 作為範本，合成包含所需編輯的新 DNA 鏈；
5、通過 DNA 修復機制，編輯被整合到基因組中。
值得一提的是，以上整個過程不依賴於細胞週期特異性的修復機制，因此可以在多種細胞類型中高效運作（圖 1）。
點擊編輯技術優勢
點擊編輯相較于現有基因編輯技術具有明顯優勢，體現在：
1、點擊編輯避免了雙鏈 DNA 斷裂，這類斷裂常導致不可預測的基因組變化、p53 啟動和細胞週期阻滯。
2、點擊編輯不依賴于同源定向修復（homologous directed repair，HDR），因此不受細胞週期的限制；
3、與堿基編輯器相比，點擊編輯能夠引入多種類型的修改，包括堿基替換、插入和刪除，而不僅限於特定類型的核苷酸變化；
4、點擊編輯使用簡單的 DNA 寡核苷酸作為範本，這些寡核苷酸易於合成、價格低廉且化學穩定性好；
5、研究者可以快速篩選不同的範本設計，無需複雜的克隆步驟，大大加速了優化過程。
點擊編輯實驗結果
研究團隊在多種人類細胞類型中測試了點擊編輯系統，結果令人印象深刻。
圖 1 概述了點擊編輯技術系統工作原理與元件。將豬環狀病毒 2（porcine cyclic virus 2，PCV2）的 HUHes 和 nCas9 與大腸桿菌 DNA 聚合酶 I（DDPI）的 Klenow 片段結合起來構建成一個點擊編輯融合蛋白（click editor，CE），即包含 nCas9、HUHes 和 DDPs；測試了多種 HUHes 和 DDPs，發現 PCV2 的 HUHes 與大腸桿菌 DDPI 的 Klenow 片段組合效率最高。當 CE 與兩個 gRNA 共轉染時，編輯效率顯著提高，達到了近 10% 的精確編輯率。
圖 1 點擊編輯技術系統工作原理及點擊編輯融合蛋白構建
接著研究團隊展示了 clkDNA 參數篩選和優化（圖 2）。通過系統地測試不同長度的 PBS 和聚合範本（polymerization template，PT）組合，形成高通量篩選方法，籍此能快速優化 clkDNA 參數，並在多個靶點上實現了約 15% 的編輯效率；較長的 PBS（>10 nt）和 PT 更有效，且適當的化學修飾能進一步提高編輯效率在多個基因位點的篩選（圖 2）。
圖 2 clkDNA 參數篩選和優化
繼後，研究團隊在 clkDNA 中添加額外的靜默突變，可以顯著提高編輯效率，最高可達 24.7 倍（圖 3）；添加的額外突變可以幫助規避細胞內的 DNA 錯配修復系統，進而保留所需的基因編輯（圖 3）；此外，研究團隊還設計了 64 種不同的含有額外堿基變化的 clkDNA，系統地評估了不同位置和類型的錯配對編輯效率的影響（圖 3），為未來設計最佳 clkDNA 提供了基礎資料。
圖 3 通過 clkDNA 修飾規避 DNA 修復
為了明晰點擊編輯技術特點和優勢，研究團隊將點擊編輯與先導編輯（prime editing，PE）作了對比實驗。觀察到 CE1 與 PE1 表現相當甚至更好，但與優化的 PE2 或 PE3 相比效率較低，這可能歸因於 PE2 或 PE3 使用了經過工程改造的 RT 結構域（圖 4）；脫靶分析可見，CE1 在脫靶位點產生的 indels 顯著低於 Cas9 核酸酶，且未檢測到精確脫靶編輯，意味著 CE1 具有高保真度的特性（圖 4）；此外，實驗還排除了 HUHes 與基因組中潛在結合位點相互作用的風險（圖 4）。
圖 4 點擊編輯與先導編輯比較和脫靶分析
最後，研究團隊探索了不同的 CE 架構設計，包括融合型、非融合型和招募型結構，並在不同人類細胞系中測試 CE 的編輯效率（圖 5）；開發了 mRNA 遞送方式，可在 HEK293T、HeLa 和 HCT116 細胞中實現高達 25.2% 的編輯效率（圖 5）；這些資料支援點擊編輯技術的廣泛適用性以及向體內應用推進的潛力。另外，通過對 29 個潛在脫靶位點的分析，發現點擊編輯產生的脫靶編輯極少，明顯低於傳統的 Cas9 核酸酶（圖 5），提示點擊編輯可能是一種高度特異性的基因組編輯方法。
綜上系列實驗結果清晰地展示了，點擊編輯技術系統創新性地將 nCas9 切割 DNA 的一條鏈能力、HUHes 的共價連接能力和 DDPs 的高保真複製能力巧妙地結合，實現精確基因組編輯；通過系統的參數優化和多種細胞系驗證，證明該技術的有效性和通用性。
圖 5 CE 構建優化及在不同細胞中的應用
未來的應用前景
由於點擊編輯技術系統基於模組化設計，研究人員可以深入操作、優化系統的各個元件，包括開發更高效的 DDPs、探索新的 HUHes 變體以及優化 clkDNA 的設計和化學修飾。這項技術的靈活性和精確性使其有望用於各種應用，從基礎研究到疾病建模，再到潛在的基因治療。隨著進一步的優化和發展，點擊編輯可能成為基因組工程領域的重要工具，為解決複雜的生物學和醫學問題提供新的思路和方法。
總結
點擊編輯技術代表了基因組編輯領域又一重大突破；它結合了高精度、多功能性和安全性，有望在生物技術和醫學研究中發揮重要作用；隨著更多研究的進行及成果的形成，期待著這項技術能為更多疾病的治療帶來新的希望。
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